筑波大学との三次共同研究

同定・単離試験

ESD500mLを酢酸エチルで分配して酢酸エチル層と水層に分ける。水層をさらにブタノールで分配してブタノール層と水層に分離する。酢酸エチル層は脂溶性の高い化合物が、水層には水溶性化合物が、またブタノール層にはその中間の化合物が含まれている。分離した各層を、エバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル層 0.9550g、ブタノール層 0.5216g、水層 7.6900gを得た。

大腸がん細胞Caco-2の細胞生存率をMTTアッセイという手法を用いて調べた。グラフの縦軸はCaco-2細胞の生存率を表し、横軸のEは酢酸エチル層、Bはブタノール層、Wは水層を示しており、数字は用いた各層の濃度(0.1, 1.0, 10 g/mL)を示している。この結果から、酢酸エチル層に顕著な殺細胞活性が認められる。

活性の認められた酢酸エチル層(ESD-EA)を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて9個のフラクション(ESD-EA-1~9)に分離した。

上記の各フラクションについてCaco-2の細胞生存率を調べた。その結果、フラクションESD-EA-2およびESD-EA-3に強い殺細胞活性が認められた。

Fig.3で得られた結果より、強い殺細胞活性が認められたESD-EA-2Sep-Pak SiO2カラムを用いて、6個のフラクション(ECO-EA-2-1~6)に分離した。

上記で得られた各フラクションについてCaco-2における細胞生存率を調べた。その結果、フラクションESD-EA-2-1およびESD-EA-2-2に、弱いながら殺細胞活性が認められた。

 

 

 

このような作業を繰り返し、活性成分を求めていきました。

 

 

結論

これまでの総括

薬事日報

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